Fosfaatpuhverdatud soolalahus (PBS) on soolane segu, mida kasutatakse bioloogilistes uuringutes. Seda kasutatakse rakkude rühma lahjendamiseks või rakkude eraldamiseks. See puhver säilitab stabiilse pH-taseme, nii et rakud ei hävine vaatamise ja säilitamise ajal. Saate teha 1-kordse lahuse, mida saab kasutada otse rakkudel, või 10-kordse lahuse, mida saab lahjendada 1-kordseks. Kui teie labor kasutab palju PBS-i, võib olla hea mõte teha 10-kordne varu, kuna see kestab kauem.
1
Koguge kokku oma materjalid ja koostisosad. Fosfaatpuhverdatud soolalahuse (PBS) 1X (tavaline katsetes kasutatav kontsentratsioon) lahuse valmistamiseks vajate 1-liitrist mõõtesilindrit, kaalu, 2-liitrist keeduklaasi, segamisvarda, segamisplaati, pH-d. meeter, autoklaav ja klaaspudel ladustamiseks. 1 L PBS-i valmistamiseks vajate iga koostisosa järgmisi koguseid: Väikesed kogused lahjendatud HCl ja/või NaOH lõpplahuse pH saavutamiseks 800 ml destilleeritud vett 8 g NaCl (naatriumkloriid) 0,2 g KCl (kaaliumkloriid) 1,44 g Na2HPO4 (dinaatriumfosfaat) 0,24 g KH2PO4 (monokaliumfosfaat) Iga ühendi lõppkontsentratsioonid peaksid olema 137 mm NaCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl ja pH 2,7 mM KCl.
2
Asetage segamisvarras keeduklaasi ja asetage keeduklaas segamisplaadi peale. Iga lahenduse tegemisel soovitakse lahendust pidevalt liikumises hoida. See aitab kõigel kiiremini lahustuda. Vee lisamisel pritsimise vältimiseks asetage segamisvarras tühja keeduklaasi ja seejärel segamisplaadi peale. Segamisvarras sisaldab magnetit, mis laseb baaril pöörlema ja lahust segada, kui asetate vedelikumahuti. mootorit sisaldaval segamisplaadil. Enne keeduklaasi sisselülitamist oodake, kuni keeduklaasis on lahust.
3
Mõõtke 2-liitrisesse keeduklaasi 800 ml destilleeritud vett, seejärel lülitage segamisplaat sisse. Lahuse valmistamisel alustage lõplikust väiksemast veekogusest. Lõpuks lisage ülejäänud vesi, et viia kogumaht 1 liitrini. Mõõtke mõõtesilindri abil 800 ml vett ja valage see otse puhtasse keeduklaasi. Keeduklaasis olev vesi lülitage sisse. segamisplaati keskmisel kiirusel. Kui segamisvarras hakkab pöörlema, peaksite nägema vees väikest mullivanni.
4
Kaaluge iga kemikaali õiged kogused. Kaaluge 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 ja 0,24 g KH2PO4. Kasutage kaalu, et kaaluda iga kemikaali ükshaaval oma kaalumispaatides. Kui lisate liiga palju kemikaali, eemaldage lihtsalt liigne kogus, kuni teil on õige kogus.
5
Lisage lahusele kõik kemikaalid ja lahustage. Valage iga kemikaal segamise ajal vette. Igaühe lisamiseks pole eritellimust, nii et saate kõik korraga lisada. Laske kõigel segada, kuni see on täielikult lahustunud. Võite lasta sellel seista, kuni teete midagi muud, ja kontrollida seda hiljem. Lahustumiseks kulub vähemalt 5-10 minutit.
6
Reguleerige lahuse pH väärtuseni 7,4. Kui kõik on täielikult lahustunud, peate reguleerima puhvri pH-d, kuni see on 7,4. Hoidke segamisvarda peal ja asetage pH-meeter lahuse ülaossa. Laske pH-meetri numbritel liikumine lõpetada. Lahus on tõenäoliselt liiga happeline, nii et peate pH reguleerimiseks lisama naatriumhüdroksiidi (NaOH). Kasutage väikest pipetti, et lisada NaOH paar tilka korraga. Pärast iga lisamist laske lahusel hetk segada ja kontrollige pH-meetri uut näitu. Lahuse pH reguleerimine on kannatlikkust nõudev protsess. Kui lähete kogemata kõrgemale kui 7,4, võite selle langetamiseks lisada paar tilka vesinikkloriidhapet (HCl).
7
Lisage vett, kuni lahust on 1 liiter. Kui pH on korralikult reguleeritud, võite lahuse viia lõppmahuni 1 liiter. Valage kogu lahus keeduklaasist ettevaatlikult 1-liitrisesse mõõtesilindrisse. Lisage nii palju destilleeritud vett, et see oleks 1 l. Valage lõpplahus 1-liitrisesse klaaspudelisse, mis on ohutu autoklaavimiseks.
8
Steriliseerige lahus autoklaavis. Asetage pudelile kaas, kuid ärge keerake seda alla. Autoklaavimisel võib rõhk pudelis tõusta ja kaane pingutamisel plahvatada. Asetage autoklaavi lindi riba üle kaane, et see autoklaavimise ajal paigal püsiks. Seadke autoklaav vedelikutsüklis 20 minutiks steriliseerima rõhul 15 psi. Autoklaavilindil on temperatuuriindikaator. Kui autoklaavi lint ei muutu protsessi lõppedes mustaks, ei läinud autoklaav piisavalt kuumaks ja peate uuesti steriliseerima.
9
Hoidke PBS-i toatemperatuuril. Pärast autoklaavimist laske PBS-il jahtuda toatemperatuurini ja seejärel keerake kaas kinni, et saasteained eemale hoida. Kaane pingutamine enne pudeli jahtumist võib tekitada vaakumi ja muuta kaane hilisema eemaldamise väga keeruliseks. PBS on toatemperatuuril stabiilne. Samuti saate PBS-i alikvooti jagada väiksematesse mahutitesse, et kasutada ükshaaval.
10
Koguge oma materjalid ja koostisosad kokku. 10X (kasutatud tavakontsentratsioonist kümme korda suurem) puljongi valmistamine on peaaegu identne 1X varu valmistamisega, lisate lihtsalt 10-kordse koguse kemikaale. 10X varu valmistamiseks vajate 1-liitrist mõõtesilindrit, kaalu, 2-liitrist keeduklaasi, segamisvarda, segamisplaati, pH-meetrit, autoklaavi ja klaaspudelit. 1 liitri valmistamiseks vajate iga ühendi järgmisi koguseid: 700 ml destilleeritud vett 80 g NaCl (naatriumkloriid) 2 g KCl (kaaliumkloriid) 14,4 g Na2HPO4 (dinaatriumfosfaat) 2,4 g KH2PO4 (monokaliumfosfaat) )Lõpplahuse pH määramiseks vajate ka väikeseid koguseid HCl-i ja/või NaOH-d. Iga ühendi lõppkontsentratsioonid 10X lahuses on 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4 ja 18 mM KH2PO4.
11
Asetage keeduklaas segamisplaadi peale ja lisage segamisvarras. Kõige kiiremaks lahustamiseks kasutage segamisvarda ja segamisplaati, et lahus pidevalt liiguks. Asetage segamisvarras enne alustamist tühja keeduklaasi, et vältida pritsmeid. Enne segamisplaadi sisselülitamist oodake, kuni keeduklaasis on lahust.
12
Mõõtke 2-liitrisesse keeduklaasi 700 ml destilleeritud vett, seejärel lülitage segamisplaat sisse. Soovite alustada väiksemast mahust kui lõplik maht, sest helitugevus muutub ühendite lisamisel. Kui kõik on lisatud ja lahustunud, lisate ülejäänud vee, et viia kogumaht 1-liitrini. Mõõtke mõõtesilindriga 700 ml vett ja valage see otse puhtasse keeduklaasi. Kui vesi on lisatud, lülitage segamisplaat sisse keskmise kiirusega. Kui segamisvarras hakkab pöörlema, peaksite nägema vees väikest mullivanni.
13
Kaaluge iga kemikaali õiged kogused. Kaaluge 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 ja 2,4 g KH2PO4. Kaaluge iga kemikaal eraldi oma kaalupaadis. Kui lisate liiga palju kemikaali, eemaldage lihtsalt liigne kogus, kuni teil on õige kogus.
14
Lahustage kõik lahuses olevad kemikaalid. Lisage iga kemikaal veele segades. Igaühe lisamiseks pole eritellimust, nii et saate kõik korraga lisada. Jätkake segamist, kuni kogu pulber on täielikult lahustunud. Lahustumiseks kulub vähemalt 5–10 minutit, seega laske sellel segada ja kontrollige seda hiljem.
15
Veenduge, et lahuse pH on 7,4. Kui kõik on täielikult lahustunud, peate kontrollima puhvri pH-d ja reguleerima selle väärtuseni 7,4. Hoidke segamisvarda peal ja sukeldage pH-meetri ots lahuse ülaossa. Praeguse pH mõõtmiseks laske pH-meetril olevatel numbritel liikumine lõpetada. Lahus on tõenäoliselt liiga happeline, nii et peate selle aluselisemaks muutmiseks lisama naatriumhüdroksiidi (NaOH). Lisage NaOH paar tilka korraga väikese pipetiga. Pärast iga lisamist laske lahusel hetk seguneda ja oodake, kuni numbrid enam ei liigu. Jätkake NaOH lisamist, kuni saavutate väärtuse 7,4. Lahuse pH saavutamine nõuab kannatlikkust. Kui lähete kogemata kõrgemale kui 7,4, võite selle langetamiseks lisada paar tilka vesinikkloriidhapet (HCl).
16
Lisage vett, et lõppmaht oleks 1 liiter. Kui pH on õigesti reguleeritud, viige lahus lõppmahuni 1 liiter. Valage kogu lahus keeduklaasist ettevaatlikult 1-liitrisesse mõõtesilindrisse. Lisage nii palju destilleeritud vett, et see oleks 1 l. Valage lõpplahus 1-liitrisesse klaaspudelisse, mis on ohutu autoklaavimiseks.
17
Kasutage lahuse steriliseerimiseks autoklaavi. Asetage pudelile kaas, kuid ärge keerake seda lõpuni alla. Autoklaaviprotsess tekitab auru, mis võib põhjustada rõhu suurenemist pudelis. Kui kaas on kinni keeratud, võib pudel plahvatada. Kasutage autoklaavimisel autoklaavimisel paigal hoidmiseks autoklaavi lindi riba üle kaane. Seadke autoklaav vedelikutsüklis 20 minutiks steriliseerima rõhul 15 psi. Autoklaavilindil on temperatuuriindikaator. Kui see saavutab õige temperatuuri, muutub lint mustaks. Kui lint ei muutu mustaks, ei läinud autoklaav piisavalt kuumaks ja peate uuesti steriliseerima.
18
Hoidke PBS-i toatemperatuuril. Pärast autoklaavimist laske PBS-il enne kaane pingutamist täielikult jahtuda. Kui pingutate kaant veel kuumana, võib see tekitada vaakumi, mis muudab kaane hilisema eemaldamise väga keeruliseks. PBS on toatemperatuuril stabiilne pikaajaliselt. Samuti saate PBS-i alikvooti jagada väiksematesse mahutitesse, et kasutada neid ükshaaval.
19
Määrake 1X lahuse kogus, mida vajate. Esiteks peate teadma, kui palju 1-kordset aktsiat soovite, enne kui saate arvutada, kui palju 10-kordset aktsiat vajate. Valmistatav kogus sõltub teie katse tüübist. Kui vajate lihtsalt 1X varu alikvooti, tehke umbes 500 ml. Saate seda 1X varu mõnda aega kasutada ja te ei pea seda nii sageli tegema.
20
Arvutage vajalik 10-kordne varu. Vajaliku 10-kordse varu arvutamiseks jagate lihtsalt kogumahu 10-ga. Pidage meeles, et õige mahu saamiseks peavad teie ühikud ühtima: kui valmistatav maht on milliliitrites, on lisatav maht milliliitrites. Näiteks: kui soovite 500 ml lahust, jagage 500 10-ga ja saate 50 ml. 500 ml 1X valmistamiseks vajate 50 ml 10-kordset põhilahust. Näiteks: kui soovite 2 liitrit lahust, jagage 2/10 ja saate 0,2 liitrit. Saate selle teisendada ml-deks, korrutades 1000-ga. Vaja on 200 ml 10X varu, et saada 2 L 1X.
21
Lahutage kogumahust 10-kordne maht. 10-kordse põhilahuse lahjendamiseks vajaliku veekoguse määramiseks peate lihtsalt soovitud kogumahust lahutama arvutatud 10-kordse mahu. Näiteks: 500 ml valmistamiseks vajate 50 ml 10-kordset põhilahust. Kuna 500–50 = 450, vajate puljongi lahjendamiseks 450 ml destilleeritud vett.
22
Lahjendage 10X puljong destilleeritud veega. Kasutades arvutatud mahtusid, lisage 10-kordsele varule destilleeritud vett. Olete nüüd valmistanud 1-kordse PBS-i varu. Näiteks lisage 50 ml 10-kordset varulahust 450 ml-le destilleeritud veele, et saada 1-kordne PBS-i varu. Lahuse segamiseks keerake mahutit.
23
Kontrollige 1X varu pH-d. Mõnikord mõjutab lahjendusprotsess puhvri pH-d. Mõistlik on kontrollida 1X põhilahuse pH-d ja veenduda, et see oleks pärast lahjendamist 7,4. Kasutage pH-meetrit pH mõõtmiseks ja kasutage HCl-i või NaOH-d, et korrigeerida puhvri pH väärtuseni 7,4.