Rakukultuur on keeruline protseduur, mida saavad teha ainult professionaalsed laboritöötajad, kuna see nõuab palju eriväljaõpet ja -varustust. Protsess hõlmab loomsest koest väikese rakuproovi võtmist ja rakkude paljunemise soodustamist. Aseptiliste protseduuride kasutamine, ideaalse kultuuri ja söötme valimine ning rakkude hoidmine sõbralikus keskkonnas aitab tagada hea proliferatsiooni. Spetsialistid alustavad oma tööpiirkonna seadistamisega, seejärel valivad katse jaoks parimad rakukultuuri materjalid. Pärast seda on oluline jälgida äsja kasvatatud rakke ja neid protsessi jätkamiseks vajaduse korral subkultuurida.
1
Seadke sisse aseptiline tööala ja steriliseerige oma seadmed. Pihustage oma tööpind ja rakukultuuri kapoti sisemus alla 70% alkoholisisaldusega desinfitseeriva pihustiga. Hüpokloriite, fenoole ja alkohole kasutatakse tavaliselt ka seadmete steriliseerimiseks laboris, kuid kontrollige, mis on teie laboris saadaval. Segaduse vähendamiseks eemaldage oma tööpiirkonnast kõik kõrvalised esemed. Ärge hoidke esemeid samas ruumis, kus teete rakukultuure. Jäta rakukultuuri kapoti ventilaator kindlasti sisse lülitatuks. Ärge lülitage seda välja, välja arvatud juhul, kui õhupuhastit pikka aega ei kasutata. Kui teil on küsimusi selle kohta, mida oma tööpiirkonna steriliseerimiseks kasutada, pidage nõu laboratooriumi juhendajaga.
2
Peske käed ja kandke isikukaitsevahendeid. Kasutage käte pesemiseks antibakteriaalset seepi ja sooja vett. Seejärel pange selga kindad, kleit, kaitseprillid, mask ja kõik muud, mille katse jaoks on vaja isikukaitsevahendeid. Kui juuksed on pikad, siduge need kindlasti kinni, et need ei oleks teelt.
3
Steriliseerige kõik kasutatavad reaktiivid, lahused või muud kandjad. See võib hõlmata autoklaavi või steriilse filtri kasutamist. Enne steriliseerimist kontrollige kasutatava kandja tüübi juhiseid. Saastumise vältimiseks sulgege kolb kohe pärast söötme steriliseerimist.
4
Saastumise vältimiseks järgige steriilseid käsitsemisprotseduure. Oma rakusöötme saastamine keemiliste või bioloogiliste ainetega võib katse rikkuda. Keemiliste saasteainete hulka kuuluvad detergendid, vesi, endotoksiinid ja saasteained rakukultuurisöötmes. Bioloogiliste saasteainete hulka kuuluvad hallitusseened, pärmseened, bakterid, viirused ja mükoplasma. Nende saasteainete rakukultuuri söötmest eemal hoidmiseks järgige alati aseptilist tehnikat. Näiteks on kõige parem kasutada söötme kolbi kandmiseks pipetti, kuna söötme sissevalamine suurendab saastumise ohtu.
5
Valige oma katsete jaoks sobiv rakuliin. Kaubanduslikelt või mittetulunduslikelt tarnijatelt saate osta laia valikut loomarakuliine. Kontrollige, mis tüüpi lahtrid on saadaval, ja valige see, mis teie katse jaoks kõige paremini sobib. Eduka katse tõenäosuse suurendamiseks vali kindlasti kvaliteetne rakuliin. Mõned kriteeriumid, mida võiksite kaaluda, on järgmised: raku liik; rakkude funktsionaalsed omadused;
6
Kasutage enamiku rakutüüpide jaoks kleepuvat kultuuri. Adherentne kultuur on kunstlik substraat, millele rakud kihistatakse. Seda tüüpi kultuur toimib kõige paremini enamiku loomarakkude jaoks, kuna nende proliferatsiooniks on vaja substraati. Siiski on kõige parem kontrollida kasutatava rakuliini spetsifikatsioone, et teha kindlaks, kas vajate seda tüüpi kultuuri. Pärast söötme lisamist kleepuva kultuuri rakkudele vaadake rakke mikroskoobi all, et näha, kas need on vabanenud. substraadist. Kui need on aluspinnast eraldunud, levivad need laiali.
7
Valige suspensioonkultuur rakkude jaoks, mis on sellega kohandatud. Suspensiooniga ei toetu rakud millelegi. Selle asemel hõljuvad need vedelikus vabalt, mis võib hõlbustada kultuuri suurendamist lisatud söötmega. Mõned rakuliinid on spetsiaalselt modifitseeritud kasutamiseks suspensioonis, seega kontrollige veendumiseks rakuliini tootjalt. Suspensioonisööde on hea valik ka rakkude jaoks, mis ei ole kleepuvad. Pidage meeles, et kui kasutate suspensiooni rakukultuuri, peate iga päev rakke loendama.
8
Valige sööde, mis sobib teie rakkudega kõige paremini. Ideaalne kultiveerimissööde varieerub sõltuvalt sellest, millist tüüpi rakke te kasutate. Pöörduge rakuliini tootja poole, et määrata teie kasutatavate rakkude jaoks ideaalne rakukultuuri sööde. Mõned levinumad tüübid on järgmised: SerumBasal media Vähendatud seerumi kandja Seerumivaba kandja
9
Kontrollige rakusöötme pH ja CO2 taset. Keskmist CO2 taset hoitakse kõigi rakuliinide puhul kõige paremini vahemikus 4–10%. Kuid söötme ideaalne pH-tase varieerub sõltuvalt teie kasutatavate rakkude tüübist, seega kontrollige alati oma rakukultuuri pH-taset. Ideaalse pH-taseme üksikasjade saamiseks pöörduge rakuliini tootja poole või kasutage kasutatavate rakutüüpide jaoks tavalisi soovitatud pH-tasemeid. Näiteks imetajarakud kasvavad kõige paremini pH väärtusega 7,4, kuid putukarakud kasvavad kõige paremini pH 6,2.
10
Optimaalse keskkonna saavutamiseks reguleerige temperatuuri. Mõned rakud arenevad ainult kitsas temperatuurivahemikus, samas kui teised rakud võivad areneda laiemas temperatuurivahemikus. Arvestage kasutatavate rakkude tüüpi ja reguleerige ümbritseva õhu temperatuur, kus te hoiate lahtreid ideaalsel tasemel. Mõned levinumad temperatuurisoovitused on järgmised: inimese ja imetaja rakud – 36–37 °C (97–99 °F) putukarakud – 27–27 °C (81–99 °F) linnurakud – 38,5 °C (101,3 °F). °F) Külmaverelised rakud – 15–26 °C (59–79 °F)
11
Loendage rakud hemotsütomeetriga kohe pärast kultuuri alustamist. Hemotsütomeeter on võrgutaoline lääts, mis läheb mikroskoobi all üle rakkude ülaosa. See võimaldab teil rakke hõlpsamini loendada, jagades rakud kvadrantideks ja muudeks väiksemateks segmentideks. Registreerige kindlasti rakkude arv hemotsütomeetri igas ruudustikus, et saaksite järgmisel loendamisel kindlaks teha, kas rakud paljunevad. .
12
Subkultuurige rakke, kui need on kahekordistunud. Kui söötmes olevate rakkude arv on kahekordistunud, saate neid kasvu jätkamiseks subkultuurida, jagades rakud kahte konteinerisse ja lisades igasse konteinerisse värsket söödet. Kasutage sama tüüpi substraati või suspensiooni söödet, mida kasutasite algse rakukultuuri jaoks. Jagage rakud 2 kolbi nii, et kummaski on pooled, seejärel lisage mahutisse 3 osa uut söödet, et sööde oleks 25% vana ja 75% uus.