Londonis asuv šoti bakterioloog Alexander Fleming avastas penitsilliini kogemata, kui ta 1928. aastal üritas uurida Staphylococcus baktereid. Ta tegi Londoni St. Mary haiglas asuvas laboris katseid bakteritega ja asetas baktereid sisaldava laborinõude lähedale. avatud aken. Katse juurde naastes avastas ta, et avatud akna kaudu puhus tassile hallitus, saastades baktereid.
Selle asemel, et oma rikutud katset minema visata, vaatas Fleming seda tähelepanelikult oma mikroskoobi all. Üllataval kombel ei näinud ta mitte ainult bakteritel vohavat hallitust, vaid ka selget tsooni hallituse ümber. Penitsilliini eelkäija Penicillium hallitus lahustas surmavaid Staphylococcus baktereid.
Fleming oli algselt optimistlik, et penitsilliin on kasulik antibakteriaalse ainena, kuna see on inimkehale ohutu, kuid samas tugev. Hiljem, 1931. aastal, muutis ta meelt ja otsustas, et see ei kesta inimestel kahjulike bakterite hävitamiseks vajalikku aega, ning lõpetas selle uurimise. 1934. aastal alustas ta veel paar aastat kestnud kliinilisi uuringuid ja püüdis leida kedagi teist, kes seda puhastaks.
Inglismaa Oxfordi ülikooli teadlased, sealhulgas Howard Florey, Ernst Chain ja Norman Heatley, katsetasid Flemingi avastust. Nad tõestasid, et penitsilliin on hiirtel kahjutu ja tõhus, kuid sellel ei olnud veel inimeste raviks vajalikku mahtu. Orvan Hess ja John Bumstead olid esimesed inimesed, kes kasutasid seda patsiendi edukaks raviks.
Penitsilliin päästis Teises maailmasõjas paljude sõdurite elud, kuid varu oli äärmiselt piiratud ja ravim eritus organismist kiiresti, mistõttu tuli patsientidele sageli doseerida. Praegu oli tavaline tava päästa ravi saavate patsientide uriini, et penitsilliini saaks eraldada ja uuesti kasutada. Lõpuks leiti, et teine aine, probenetsiid, pikendab penitsilliini toimeaega inimkehas.
Fleming, Florey ja Chain said 1945. aastal Nobeli meditsiiniauhinna penitsilliini avastamise ja arendamise eest. Florey oli avalikult mures tervishoiu parandamisest tuleneva rahvastikuplahvatuse võimaluse pärast ja ütles, et tema töö antibiootikumiga on pigem huvitav teaduslik probleem kui inimeste abistamise viis. Ta tunnistas küll, et see, et see võib inimesi aidata, oli hea, kuid mitte põhjus, miks ta algselt huvitatud oli.
Andrew J. Moyer avastas hiljem, kuidas valmistada suuri koguseid penitsilliini, patenteerides protsessi ja edendades võitlust nakkushaiguste vastu. 1987. aastal valiti ta riiklikku leiutajate kuulsuste halli suures koguses penitsilliini loomise protsessi eest.