Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on tehnika, millel on mitmesuguseid rakendusi teadusuuringutes, meditsiinis ja kohtuekspertiisi valdkonnas. See võimendab huvipakkuvat DNA fragmenti. See on ka tundlik test haiguste diagnoosimiseks ja genotüpiseerimiseks. Reaktsioonisüsteemi põhikoostisosade hulka kuuluvad DNA matriits, puhverlahus, desoksüribonukleosiidtrifosfaat (dNTP), Taq polümeraas ja paar praimereid (eespoolne ja vastupidine). Õigesti disainitud kruntvärvid vähendavad kulusid ja katsetamiseks kuluvat aega. Primer-BLAST on võimas tööriist mallile omaste praimerite leidmiseks. Selle tööriista kasutamine on tasuta ja see ei nõua tarkvara installimist ega programmeerimisoskusi. See artikkel demonstreerib, kuidas kujundada PCR-praimereid Primer-BLAST näite abil.
1
Minge veebisaidile Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Pange tähele, et RefSeqi liitumine on eelistatud mallivorming. Viitejada (RefSeq) kogu on sekundaarne andmebaas, mille mitteliigne teave on valitud esmasest andmebaasist GenBank. Primer-BLAST on praimerite kujundamise tööriist, mille on välja töötanud Riiklik Biotehnoloogia Teabekeskus (NCBI). NCBI kui molekulaarbioloogia teabe riiklik ressurss haldab bioloogiaandmebaase ja hõlbustab selliste andmebaaside kasutamist. Kuna kogu geneetiline teave on saadud bioloogiliste uuringute käigus. lõpuks hoiustab NCBI hallatavatesse andmebaasidesse, sobib Primer-BLAST igale organismile seni, kuni on valitud õiged parameetrid.
2
Otsustage praimerite eesmärk. Eesmärk mõjutab krundi disaini. Sellised parameetrid nagu PCR toote pikkus ja praimerite asukohad sõltuvad suuresti eesmärgist. Kas selleks on kogu geeni amplifitseerimine või geeni olemasolu kontrollimine või selle ekspressioonitaseme tuvastamine või muud eesmärgid? Võtke näide. Olgu huvipakkuvaks geeniks mudelorganismis Drosophila melanogaster (harilik äädikakärbes) kasvaja supressorgeen p53. Olgu eesmärgiks tuvastada selle geeni ekspressioonitase. Sel juhul seonduvad praimerid pöördtranskribeeritud komplementaarse DNA-ga (cDNA). ) genoomi asemel messenger RNA-st (mRNA). Seega kitseneb mall p53 kodeeriva järjestusega (CDS).
3
Teadke PCR malli. Nukleotiidjärjestuste allikas varieerub sõltuvalt uuringu erinevatest olukordadest. Selle saab genereerida järjestuse tulemuse kaudu või saada andmebaasist. Kui see pärineb töötlemata järjestuse tulemusest, minge otse osasse “BLAST-i käivitamine töötlemata järjestuse jaoks”. Kui see pärineb andmebaasist, mängige selle andmebaasiga mõnda aega. Drosophila melanogaster p53 geeni puhul on annoteeritud järjestus saadaval NCBI andmebaasis. Minge NCBI kodulehele (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tippige otsinguribale märksõnad. Loogilised operaatorid, nagu JA, VÕI, EI, on sellel ribal rakendatavad. Klõpsake otsingul ja uurige teavet Drosophila melanogaster p53 geeni kohta.
4
Hankige juurdepääs andmebaasist leitud järjestuste jaoks. Praimer-BLAST identifitseerib matriitsi paremini RefSeq liitumise kui toores DNA järjestuse järgi. Teine RefSeq-i liitumise eelis on see, et eksoni / introniga seotud funktsioonid on saadaval ainult siis, kui RefSeq-i mRNA järjestus sisestatakse PCR-matriitsina. Kui jada on hangitud veebiandmebaasist, otsige lihtsalt NCBI kodulehelt märksõnad, et saada selle RefSeq-i liitumine. Seejärel jätke osa “BLASTI käivitamine töötlemata järjestuse jaoks” vahele ja minge otse osa juurde “Parameetrite reguleerimine”.
5
Juurdepääs RefSeqi andmebaasile töötlemata järjestuse liitumiseks. Seotud RefSeq-i liitumine on juurdepääsetav põhilise kohaliku joonduse otsingutööriista (BLAST) kaudu. Toorjada RefSeq-ühenduse leidmine tähendab selle töötlemata järjestusega identse järjestuse otsimist NCBI andmebaasist. Jätkake näitega. Demonstreerimiseks oletame, et Drosophila melanogaster p53 geen ei ole annoteeritud. Selle töötlemata järjestuse saamiseks minge Drosophila andmebaasi (http://flybase.org). Tippige “p53” geeniribale Hüppa. See navigeerib selle geeni juurde. Leidke Drosophila melanogaster p53 geeni CDS. Avage BLAST-i veebisait (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Kuna see joondab antud juhul DNA järjestuse teise DNA järjestusega, klõpsake nuppu nukleotiidi BLAST nupp.
6
Kopeerige järjestus või laadige Flybase’ist alla FASTA. FASTA on standardvorming nukleotiidikoodide salvestamiseks bioinformaatikas. Peaaegu kõik tekstitöötlustööriistad saavad seda tüüpi faili avada ja redigeerida.
7
Käivitage BLAST. Kleepige CDS päringujärjestuse kasti. Kerige alla ja klõpsake kohaliku joonduse käivitamiseks BLAST.
8
Valige RefSeq-i liitumine, mis vastab sihtmallile. Pöörake tähelepanu BLAST-i tulemuses loetletud teabele. Määrake sobiv ühinemine. Ilmselt peaks joondamise identsus olema 100%, et tagada RefSeq-i liitumine, mis esindab sihtmalli. Kui 100% identsusega tabamust pole, tähendab see, et päringujärjestus on halvasti uuritud. Sel juhul kasutage Primer-BLAST töötlemata järjestust. Deponeerige see uus järjestus GenBanki, et anda oma panus bioloogia andmebaasi.Teine oluline punkt on sobitada kirjeldust, mis räägib organismist ja järjestuse nimest. Näites sobivad nii RefSeq NM_001170223.1 kui ka allolev järjestus. . Hea on valida üks neist.
9
Käivitage valitud võrdlusjärjestuse ja sihtmalli paarikaupa joondus. Pidage meeles, et sobitatud liitumisega viitejada pikkus ei ole tavaliselt sihtmalliga identne. Paaripõhine joondus võib leida täpselt sama piirkonna. Minge EMBL-EBI paarisjärjestuse joondamise tööriista veebisaidile (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/). Valige kohalik joondusalgoritm. Drosophila melanogaster p53 geeniekspressioonitaseme tuvastamise näites kopeerige ja kleepige järjestus NM_001170223.1 ühte kastidest; p53-RC CDS teise kasti. Programmi käivitamiseks klõpsake saatmisnupul.
10
Registreerige võrdlusjärjestuse positsioonid, kus kaks fragmenti joonduvad. Joonduse esimene ja viimane number tähistavad algus- ja lõpp-punkti, kus kaks fragmenti joonduvad. Näites näitab tulemus, et p53-RC CDS algab järjestuse NM_001170223.1 630. nukleotiidiga ja lõpeb 1787. nukleotiidiga. Lokaalse joondamise põhjus peitub siin. EMBI-EBI joondustööriist tagastab tulemuse tekstivormingus. Ilma ruudustikuta on positsioone raske lugeda. Mugavalt jätab selle tagastatud kohaliku joonduse tulemus välja joondamata piirkonnad ja kuvab joondatud positsioonid otse.
11
Sisestage PCR malli teave rakendusse Primer-BLAST.Näites on RefSeq-i liitumine NM_001170223.1.Edaspidine praimer positsioonist on 630. Vastupidine praimer positsioonini on 1787. Ülaltoodud kaks parameetrit piiravad vahemikku CDS-i piirkonnas p53-RC. Need pole vajalikud, kui mall ei ole RefSeq-i liitumine, mis on saadud töötlemata järjestusest BLAST.
12
Reguleerige praimeri parameetreid. Primer-BLASTis tõstab süsteem automaatselt kollasena esile vaikeväärtustest erinevad parameetrite väärtused. Näites toodud geeniekspressioonitaseme tuvastamiseks piisab suhteliselt lühikesest PCR-produktist. Seega on PCR-i toote minimaalne ja maksimaalne suurus vastavalt 100 ja 250.
13
Reguleerige eksoni/introni valikut. See samm ei ole genoomse DNA praimeri kujundamiseks vajalik. Kuid see on oluline cDNA praimeri kujundamisel, kuna see võimaldab teadlasel tulevaste katsete käigus kontrollida, kas cDNA proovis on genoomse DNA saastumine. Kuna matriitsiks on cDNA, lülitage näites sisse introni kaasamise valik. Genoomsel DNA-l oleks pikem PCR saadus kui cDNA matriitsil.
14
Reguleerige praimeri paari spetsiifilisuse kontrollimise parameetreid. Sisesta organismi nimi, et programm saaks otsida vastavast andmebaasist. Ranguse puhul on praimeri spetsiifilisus seda rangem, mida rohkem on ebakõlasid ja mida suurem on ebakõlade arv, mis on vajalik soovimatute sihtmärkide ignoreerimiseks. Näites on organism Drosophila melanogaster. See katkestab tõhusalt sidumise soovimatute sihtmärkidega. Selle programmi piirang soovimatu sihtmärgi tuvastamiseks on kuni 35% mittevastavust, mis tähendab 7 mittevastavust 20 nukleotiidiga praimeri puhul.
15
Laiendage menüüd Täpsemad parameetrid.
16
Optimeerige praimeri parameetreid. GC sisaldus vahemikus 40-60% annab õiglase sulamistemperatuuri. Maksimaalne vastuvõetav polü-X väärtus on 4. Sama aluse järjestikuseid nukleotiide tuleks üldiselt vältida. Määrake Max Poly-X väärtuseks 3, et vähendada vale täitmisvõimalust.
17
Praimeri dimeeride vältimiseks vähendage maksimaalset enese- ja paaride komplementaarsust. Kuna PCR-reaktsiooni varajastes tsüklites on matriitsi kontsentratsioon palju madalam kui praimerite oma, siis kui praimerid kergesti endaga seonduvad, seonduvad vähesed praimerid matriitsiga, et algatada nukleotiidahela pikenemine. Komplementaarsete nukleotiidide arvu piiramine praimerites parandab tõhusust.
18
Looge kavandatud praimerid. Kerige alla ja klõpsake aabitsakandidaatide hankimiseks nuppu Hangi praimerid. Tavaliselt kulub programmi käivitamiseks vähem kui 2 minutit. Mõnikord, eriti tööajal, on server täisvõimsusel. See paneb taotlused ootenimekirja ja tulemuse saamiseks võib kuluda rohkem kui pool tundi. Nõuanne on selliseid tipptunde vältida.
19
Valige nende kandidaatide hulgast 2-3 paari. Esmalt sünteesitakse üks paar. Ülejäänud paarid toimivad varukoopiatena. Kandidaatide hulgast varuaabitsate valimisel on parem valida erinevad paarid kui sarnased. Kui ühel praimeripaaridest on eksperimentaalses testis madal efektiivsus või spetsiifilisus. Sarnastel on tõenäoliselt sama probleem. Drosophila melanogaster p53 geeniekspressioonitaseme tuvastamise näites on tagastatavate praimeripaaride arv seatud vaikeväärtusele 10. Programm annab 10 kandidaatpraimeripaari. Kandidaatpraimerid on selgitamise eesmärgil rühmitatud erinevates värvides. Primer-BLAST-i algsel tulemusel on ainult üks värv.Kui esmalt sünteesitakse punased praimerid, kuid see katses ebaõnnestub, võivad varukoopiad olla rohelised, kollased või mustad praimerid.Kuid parem on mitte valida. praimerite paarid on tagavaraks sinised, sest punaste ja siniste praimerite vahel on kattumine.
20
Kontrollige sünteesitud praimerite kvaliteeti eksperimentaalselt. Käivitage PCR, kasutades sünteesitud praimerite paare. Testige selle tõhusust ja spetsiifilisust, analüüsides geelelektroforeesi tulemust või kõrglahutusega sulamisanalüüsi (HRMA). Kui praimerid ei läbi testi, sünteesige varupaar ja korrake kontrolletappi, kuni leitakse sobiv paar. Elektroforeesi sidumise kõrge heledus või HRMA fluorestsents näitab testitud praimerite efektiivsust. Üksik sidumine elektroforees või üks sulamispiik HRMA-s näitab testitud praimerite spetsiifilisust.Näites on praimerid mõeldud kvantitatiivseks PCR-iks (qPCR). Praimerite kvaliteedi kontrollimiseks on oluline järgida qPCR efektiivsuse määramise protokolli.