Gramvärvimine on kiire protseduur, mida kasutatakse bakterite esinemise otsimiseks koeproovides ja bakterite iseloomustamiseks grampositiivseteks või gramnegatiivseteks, lähtudes nende rakuseinte keemilistest ja füüsikalistest omadustest. Bakteriinfektsiooni diagnoosimise esimese sammuna tuleks peaaegu alati teha Grami plekk. Grami plekk on oma nime saanud Taani teadlase Hans Christian Grami (1853–1938) järgi, kes töötas selle tehnika välja 1882. aastal ja avaldas selle 1884. aastal kui meetodit, mis eristab kahte tüüpi sarnaste kliiniliste sümptomitega baktereid: Streptococcus pneumoniae (ka tuntud kui pneumokokk) ja Klebsiella pneumoniae bakterid.
1
Valmistage ette laboritööks. Pange kindad kätte ja siduge pikad juuksed kinni, et vältida uuritava bakteriproovi saastumist. Desinfitseerige tööruum tõmbekapi all või muus hästi ventileeritavas kohas. Enne alustamist kontrollige, kas bunseni põleti ja mikroskoop on töökorras.
2
Steriliseerige mikroskoobi alusklaas. Kui alusklaas on määrdunud, peske seda rasva ja mustuse eemaldamiseks seebivees. Desinfitseerige alusklaas etanooli, klaasipuhastusvahendi või mõne muu labori soovitatud meetodiga.
3
Lisage proov slaidile. Grami peitsimise meetodit saate kasutada meditsiinilistes proovides esinevate bakterite või Petri tassis kasvatatud bakterikultuuride tuvastamiseks. Selleks, et Grami peitsist oleks kasu, lisage plekile õhuke kiht proovi. Soovitatav on võtta alla 24 tunni vanune proov, kuna vanematel bakteritel võivad olla kahjustatud rakuseinad, mis reageerivad grammidega värvimisele vähem etteaimatavalt. Kui kasutate koeproovi, lisage slaidile 1–2 tilka. Jaotage see ühtlaselt slaidile, et moodustada õhuke määrdumine, kasutades teise steriliseeritud slaidi serva. Laske sellel enne jätkamist õhu käes kuivada. Kui võtate Petri tassist baktereid, steriliseerige inokulatsioonisilmus Bunseni põleti leegis, kuni see hõõguma hakkab, seejärel laske sellel jahtuda. Kasutage seda, et asetada slaidile tilk steriilset vett, seejärel steriliseerida ja jahutada silmus uuesti, enne kui kannate väikest bakteriproovi ja segage õrnalt vette. Puljongis olevad bakterid tuleb segada keerisega ja seejärel lisada inokulatsioonisilmuse abil. nagu eespool, ilma täiendavat vett lisamata. Kui teil on tampooniproov, rullige tampooni kergelt üle slaidi.
4
Kinnitage määrdumine kuumaga. Kuumus kinnitab bakterid slaidile, nii et neid ei loputata pleki ajal nii kergesti maha. Laske slaid kiiresti kaks kuni kolm korda läbi Bunseni põleti leegi või kuumutage seda elektrilise slaidi soojendaja peal. Ärge kuumutage üle, muidu võivad näidised moonduda. Kui kasutate Bunseni põletit, peaks leek olema väike sinine koonus, mitte kõrge oranž. Teise võimalusena võib määrdumise fikseerida metanooliga, lisades kuivatatud määrdile 1-2 tilka metanooli, kurnades ülejäägi ära. metanooliga ja lasta sellel õhu käes kuivada. See meetod minimeerib peremeesrakkude kahjustusi, andes puhtama tausta.
5
Asetage slaid värvimisalusele. Värvimisalus on madal metallist, klaasist või plastikust nõu, mille ülaosas jookseb väike võrk või traattugi. Asetage slaid selle toe peale, et kasutatavad vedelikud saaksid alusele voolata. Kui teil pole värvimisalust, saab slaidi asetada otse plastist jääkuubikualuse peale.
6
Ujutage määrdumine kristallvioletiga. Kasutage pipetti, et ujutada bakteriproov üle mitme tilga kristallvioletse värvainega, mida mõnikord nimetatakse emajuurvioletseks. Oodake kolmkümmend kuni kuuskümmend sekundit. Kristallviolett (CV) dissotsieerub vesilahustes CV+ ja kloriidi (Cl–) ioonideks. Need ioonid tungivad läbi nii grampositiivsete kui gramnegatiivsete rakkude rakuseina ja rakumembraani. CV+ ioon interakteerub bakterirakkude negatiivselt laetud komponentidega, et värvida rakud lillaks. Paljud laborid kasutavad “Huckeri” kristallvioletti, mis lisab sadestumise vältimiseks ammooniumoksalaati.
7
Loputage kristallviolett õrnalt maha. Kallutage slaidi ja kasutage pesupudelit, et pritsida väike joa destilleeritud või kraanist vett üle slaidi. Vesi peaks voolama üle määrdumise pinna, kuid mitte otse sellele suunata. Ärge loputage liigselt, kuna see võib eemaldada grampositiivsete bakterite pleki.
8
Kastke määrd üle joodiga, seejärel loputage. Kasutage pipeti, et katta määrdumine joodiga. Laske sellel mõjuda vähemalt 60 sekundit, seejärel loputage maha sama ettevaatliku meetodiga. Jood negatiivselt laetud ioonide kujul interakteerub CV+-ga, moodustades suuri kristallvioleti ja joodi komplekse (CV-I kompleksid) raku sise- ja väliskihis. See hoiab rakus purpurse kristallvioletse värvuse kinni kõikjal, kus see on määrdunud. Jood on söövitav. Vältida sissehingamist, allaneelamist või kokkupuudet nahaga.
9
Lisage värvieemaldusaine ja loputage kiiresti. Selle kriitilise etapi jaoks kasutatakse tavaliselt atsetooni ja etanooli 1:1 segu, mis tuleb hoolikalt ajastada. Hoidke slaidi nurga all, seejärel lisage värvieemaldajat, kuni äravoolus pole enam violetset värvi näha. Tavaliselt kulub selleks alla 10 sekundi või isegi vähem aega, kui värvieemaldusvahend sisaldab suuremas kontsentratsioonis atsetooni. Lõpetage kohe, vastasel juhul eemaldab värvieemaldaja kristallvioletse pleki nii grampositiivsetelt kui negatiivsetelt rakkudelt ja plekki tuleb korrata. Loputage liigne värvieemaldaja kohe maha, kasutades varasemat tehnikat. Selle asemel võib kasutada puhast (95%+) atsetooni. Mida rohkem atsetooni on, seda kiiremini värvieemaldaja töötab, nõudes täpsemat ajastust. Kui teil on selle sammu ajastamisega probleeme, kaaluge värvieemaldi tilkhaaval lisamist.
10
Kastke määrdumine vastupeitsiga üle, seejärel loputage. Gramnegatiivsete ja grampositiivsete bakterite vahel kontrasti lisamiseks kasutatakse kontrastvärvi, tavaliselt safraniini või fuksiini, värvides värvitu (gramnegatiivsed) bakterid roosaks või punaseks. Jätke see mõjuma vähemalt 45 sekundiks, seejärel loputage maha. Fuchsin värvib paljusid gramnegatiivseid baktereid, nagu Haemophilus spp ja Legionella spp. See võib olla parem valik algajatele.
11
Kuivatage slaid. Võite lasta slaidil õhu käes kuivada või kuivatada, kasutades selleks müüdavat paberit. Grami plekk on valmis.
12
Valmistage ette valgusmikroskoop. Asetage slaid valgusmikroskoobi alla. Bakterite suurus on väga erinev, seega on vajalik kogusuurendus 400-1000x. Nende suurenduste suuremate otste puhul on suurema selguse huvides soovitatav kasutada õlikümblusobjektiivi. Asetage slaidile tilk sukeldusõli, vältides pealekandmise ajal liikumist, et vältida mullide teket. Liigutage mikroskoobi torni nii, et objektiivi lääts klõpsatab oma kohale, puudutades õli. Õlikümblust saab kasutada ainult spetsiaalselt loodud objektiividel, mitte “kuival” läätsedel.
13
Määrake grampositiivsed ja gramnegatiivsed bakterid. Uurige objektiklaasi valgusmikroskoobi all. Gram-positiivsed bakterid näivad lillad tänu nende paksude rakuseinte vahele jäänud kristallvioletsele. Gramnegatiivsed bakterid tunduvad roosad või punased, kuna violetne uhtus läbi õhukeste rakuseinade, seejärel sisenes neisse roosa vastuplekk. Kui proov on liiga paks, võite näha valepositiivseid tulemusi. Värvige uus proov, kui kõik bakteritüübid on grampositiivsed, veendumaks, et tulemus on õige. Kui värvieemaldaja töötas liiga kaua, võite näha valenegatiivseid tulemusi. Värvige uus proov, kui kõik bakteritüübid on gramnegatiivsed, et oma tulemusi veelkord kontrollida.
14
Otsige üles võrdluspildid. Kui te pole kindel, mis bakter on, vaadake läbi võrdluspiltide kogum, mis on sorteeritud grammi pleki kuju ja tulemuse järgi. Andmebaase leiate Internetist riiklikust mikroobide patogeenide andmebaasist ja paljudest muudest saitidest. Identifitseerimise hõlbustamiseks on levinumad või diagnostiliselt olulised näited sorteeritud allpool grammi oleku ja kuju järgi.
15
Tuvastage grampositiivsed bakterid kuju järgi. Baktereid liigitatakse mikroskoobi all veel nende kuju järgi, enamasti kokkideks (sfäärilised) või vardadeks (silindrilised). Siin on mõned levinumad grampositiivsed (lillaga värvunud) bakterid, mis on organiseeritud kuju järgi: Grampositiivsed kokid on üldiselt kas stafülokokid (tähendab kokke klastrites) või streptokokid (tähendab kokke ahelates). Grampositiivsed vardad on Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ja Listeria. Actinomyces spp. vardadel on sageli oksad või niidid.
16
Tuvastage gramnegatiivsed bakterid. Gramnegatiivsed (roosa värviga) bakterid liigitatakse sageli kolme rühma. Kokid on sfäärilised bakterid, vardad on pikad, peenikesed bakterid ja kokoidpulgad on kusagil vahepeal. Gramnegatiivsed kokid on kõige sagedamini Neisseria spp. Gramnegatiivsete vardade hulka kuuluvad E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella , Shigella, Pseudomonas ja paljud teised. Vibrio cholerae võib esineda tavaliste või kõverate varrastena. Gramnegatiivsete “kokoidsete” varraste (või “coccobacilli”) hulka kuuluvad Bordetella, Brucella, Haemophilus ja Pasteurella.
17
Hinnake segaseid tulemusi. Mõnda bakterit on nende rakuseinte hapruse või vahalisuse tõttu raske täpselt värvida. Neil võib samas lahtris või sama määrdu erinevate rakkude vahel olla lilla või roosa plekk. See probleem võib esineda kõigil üle 24 tunni vanustel bakteriproovidel, kuid mõnda liiki on raske igas vanuses värvida. Need võivad vajada spetsiifilisemaid teste, et identifitseerimist kitsendada, nagu happekindel värvimine, kultuuri kasvu jälgimine, TSI söötmekultuurid või geneetiline testimine. Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ja Propionibacterium spp. Kõiki peetakse grampositiivseteks bakteriteks, kuid sageli on need ebaselgelt värvitud.Väikesed ja peenikesed bakterid, nagu Treponema, Chlamydia ja Rickettsia spp. neid on raske korralikult Gram-värvida.
18
Visake materjalid ära. Jäätmete kõrvaldamise protseduurid erinevad laborites ja olenevalt kasutatavatest materjalidest. Tavaliselt visatakse värvimisaluses olev vedelik suletud pudelitesse ohtlike jäätmetena. Leotage slaide 10% pleegituslahuses ja visake need seejärel teravate esemete konteineritesse.