Glütserooli põhiaine on teatud tüüpi suspensioon, mida kasutatakse laboritingimustes bakterikultuuride pikaajaliseks säilitamiseks. Kui 50% glütserooli lahusele lisatakse vedelad bakterikultuurid, infundeerub glütserool bakterirakkudesse, muutes need struktuurselt stabiilseks ja võimaldades neid ohutult säilitada. Pärast proovide segamist külmutage need temperatuuril 80 °C, et tagada nende elujõulisus nii kaua kui võimalik.
1
Valmistage ette nende bakterite vedelkultuur, mida soovite säilitada. Selleks, et glütserooli varu oleks efektiivne, tuleb see kombineerida vedela bakterikultuuriga. Vedelkultuuri tootmiseks peate inkubeerima bakteriproovi üleöö Erlenmeyeri kolvis, mis on täidetud lüsogeense puljongi ja õige kontsentratsiooniga antibiootikumiga. Kui olete vedelkultuuri ette valmistanud, võite bakterid ladustada või jätkata plasmiidi eraldamist. DNA.Lüsogeenne puljong (tuntud ka kui “LB puljong” ja “LB vedelik”) on toitaineterikas vedelik, mida kasutatakse bakterite kiireks paljundamiseks. Seda saab osta jaemüüjalt, kes müüb laboriseadmeid ja -materjale. Bakterikultuuride inkubeerimine on väga tehniline protsess, mis hõlmab paljusid erinevaid muutujaid. Sel põhjusel on seda kõige parem teha koolitatud tehnik kontrollitud laboritingimustes.
2
50% glütseroolilahuse saamiseks lahjendage puhast glütserooli destilleeritud vees. Mõõtke steriilse pipetiga 10 ml mõlemat vedelikku ja ühendage need ühte kolbi. Segage või loksutage kolbi põhjalikult, kuni vedelikud on ühtlaselt segunenud. Glütserooli lahjendamine on vajalik, et see ei kahjustaks bakterirakke. Mõned teadlased eelistavad kasutada glütserooli lahust, mille sisaldus on 15–40%, et vältida bakterikultuuri kahjustamist. . Kuid 50% segu tagab ladustamisel maksimaalse pikaealisuse.
3
Viige 50 mikroliitrit 50% glütserooli lahust mikrofuugitorusse. Lekke vältimiseks viige lahjendatud glütserool ettevaatlikult uude viaali. Kasutage seda sama mahutit glütseroolilahuse infundeerimiseks vedela bakterikultuuriga ja asetage proov külmhoonesse. Võimaluse korral kasutage keeratava korgiga katsutit, mitte klõpsatusega katsutit. On teada, et klõpsuga torud avanevad segamise ja pikaajalise ladustamise ajal kogemata.
4
Lisage lahusele 50 mikroliitrit oma vedelat bakterikultuuri. Kasutage värsket pipetti, et mõõta välja võrdne kogus vedelkultuuri ja valada see otse katsuti glütserooli lahusesse. Teie glütseroolivarude lõplik osakaal peaks olema 50% baktereid ja 50% lahjendatud glütserooli. Glütserooli ja vedelkultuuri ebaproportsionaalsete koguste kasutamine võib mõjutada bakterite vastupidavust ja vähendada aega, mille jooksul see külmhoones säilib. Kui kasutate uuesti madalama kontsentratsiooniga glütseroolilahust, peate vastavalt kohandama bakterikultuuri kogust. Lisateabe saamiseks vaadake kirjandust, mis on seotud täpselt salvestatava tüvega.
5
Asetage torule kaas. Kruvige kaas oma kohale või vajutage alla, kuni kuulete vaikset klõpsatust, kui kasutate klõpsuga toru. Enne edasiliikumist veenduge, et kaas on kindlalt kinnitatud.
6
Raputage katseklaasi õrnalt, et bakterikultuur ja glütserool seguneksid. Vispelda tuubi paar korda edasi-tagasi, kuni mõlemad vedelikud on ühtlaselt jaotunud. Sel hetkel hakkavad bakterirakud aeglaselt neelama glütseroolilahust, mis stabiliseerib ja kaitseb rakumembraani riknemise ja temperatuuriga seotud kahjustuste eest. Hoia pöialt tugevalt vastu mikrofuugitoru kaant raputamise ajal, et veenduda, et see lahti ei tule.
7
Märgistage bakteriproov. Kirjutage kultuuri nimi väikesele katseklaasi sildile või maalriteibi ribale ja kleepige see mikrofuugituubi külge, kus see on selgelt nähtav. Bakterite klassifikatsiooniteabe saate ka vildiotsaga markeri abil otse kaanele kirjutada. Kindlasti märkige üles ka muu teave, mis võib analüüsi käigus kasulikuks osutuda, näiteks proovi täpne tüvi või selle päritolu. Proovianumate märgistamine on kogumisprotsessi asendamatu samm, kuna see võimaldab teil jälgida nende sisu, kui neid hoiustatakse ja sealt välja viiakse.
8
Külmutage proov temperatuuril 80 °C (112 °F). Asetage märgistatud proov ülejahutatud laboratoorsesse sügavkülmikusse, mis on seatud konstantsele temperatuurile 80 °C (112 °F). Nendes tingimustes säilib bakterikultuur elujõulisena mitu aastat. On oluline, et sügavkülmiku temperatuur jääks fikseeritud tasemele Â’80Â °C. Kui see on soojemaks seatud, võivad säilinud bakterid surra.
9
Kraapige üles väike kogus külmutatud baktereid, et need analüüsiks ette valmistada. Kui on aeg proovi taaselustada, eemaldage mikrofuugitoru sügavkülmast ja avage kaas. Kasutage steriilset inokulatsioonisilmust, hambaorki või pipeti otsa, et koguda proovi ülaosast väike kogus külmunud materjali ja kanda bakterid uurimiseks või testimiseks LB-agarplaadile. Olge ettevaatlik, et kraapivad bakterid ei sulaks. Võib aidata hoida tuubi kuival jääl, kuni olete testid lõpetanud. Tõmmake proov sügavkülmast välja ainult siis, kui see on hädavajalik. Korduv sulatamine ja taaskülmutamine vähendab oluliselt selle eluiga.