Mis on RNA amplifikatsioon?

RNA amplifikatsioon on protsess, mis võtab mõned koopiad ribonukleiinhappe (RNA) osast ja loob tuhandeid koopiaid, mis on koostiselt identsed. RNA tükid on makromolekulid, mis koosnevad nukleotiidide jadadest, seega on amplifikatsioon mitmeetapiline protsess, mis hõlmab RNA tükist täpse nukleotiidide järjestuse reprodutseerimist. RNA amplifikatsioon on kasulik uuringutes, mis hõlmavad viiruseid, mille geneetilist materjali saab salvestada DNA asemel mälu-RNA-na (mRNA); geeniekspressiooni uurimine organismides; ja valkude loomine transkriptsioonilisest RNA-st (tRNA). RNA amplifitseerimiseks luuakse ja amplifitseeritakse komplementaarne järjestus, mida kasutatakse seejärel RNA koopiate loomise mallina. RNA amplifikatsiooniks on vaja DNA vahendajat, sest RNA esineb üldiselt ainult üheahelalisel paaritumata kujul, seega tuleb RNA transkriptaasi ensüümi toimimiseks luua DNA matriit; RNA-d ei saa iseendast transkribeerida.

Huvipakkuv RNA järjestus tuleb esmalt eraldada saasteainest, enne kui saab alustada RNA amplifikatsiooni. Pärast seda lisatakse RNA matriitsile ensüümi pöördtranskriptaas. Pöördtranskriptaasi kasutatakse algse mRNA-ga komplementaarse aluspaaride rakulise DNA (cDNA) järjestuse loomiseks. Seda esimest cDNA ahelat saab seejärel kasutada cDNA teise ahela loomiseks, mida saab kasutada polümeraasi ahelreaktsioonis – protsessis, mis amplifitseerib DNA ahelaid korduvate DNA replikatsioonitsüklite ja sellele järgneva kahe ahela eraldamise kaudu. cDNA sisaldab tavaliselt DNA järjestuse ühes otsas praimereid või ensüüme, mis toimivad signaalidena nukleotiidide sidumiseks ja seega algjärjestusega identsete mRNA ahelate tootmiseks.

RNA amplifikatsiooniks on mitu meetodit, kuid meetodit, mis annab suurima koguse mRNA-d, mis on truu originaalkoopiale, nimetatakse malli vahetamise meetodiks. See meetod kasutab Moloney hiire leukeemiaviiruse pöördtranskriptaasi ensüümi, mis lisab pärast selle ahela loomist RNA matriitsist esimese ahela cDNA lõppu praimeri piirkonna. See praimeri piirkond lisatakse ka cDNA teisele ahelale, millest tehakse amplifitseeritud RNA koopiad. Teise ensüümi, mida nimetatakse promootoriks, saab siduda cDNA teise ahela praimeri piirkonnaga, mis suurendab drastiliselt RNA koopiate hulka, mis sellest cDNA ahelast transkriptsiooni teel toodetakse.