Akrüülamiidgeelid on elektroforeesi põhikomponent, protsess, mis hõlmab erinevat tüüpi molekulide eraldamist suuruse järgi. Need koosnevad enamasti keemilistest ühenditest akrüülamiidist ja bisakrülamiidist koos sobiva pH-ga puhvriga, vabade radikaalide allikaga ja spetsiaalse stabilisaatoriga, mis käivitab polümerisatsiooni. Kui geel on jõudnud tahkuda, saab seda kasutada DNA, RNA ja erinevate valgumoodustiste analüüsimiseks.
1
Lisage sobiv baaskogus ddH2O 10 ml koonilisse viaali. Pigistage ddH2O aeglaselt oma viaali pipetiga. Olge ettevaatlik, et mitte lisada rohkem ega vähem kogust, kui on nõutav järgitavas retseptis, mis varieerub olenevalt konkreetsest vormingust (valgutüübist), mida kavatsete analüüsida.”ddH2O†on keemiline lühend sõnale “double” destilleeritud vesi – see on vesi, mis on puhastatud tundlike laborirakenduste jaoks sobiva tasemeni. Näiteks 12% jooksva geeli valmistamiseks peaksite alustama 1650 μl ddH2O-ga. Mikroliiter (μl) on väga väike vedeliku mõõt, mis vastab ühele miljondikule liitrist.
2
Seejärel kasutage sobivas kontsentratsioonis naatriumdodetsüülsulfaati (SDS). Kasutage eraldi puhast pipetti, et viia SDS oma segamisviaali. SDS “maskeerib teie testitavate valkude sisemise laengu, andes neile kõigile sarnase laengu ja massi suhte. Kui geelile rakendatakse elektrivälja, põhjustab see erinevate valkude migreerumist anoodi poole erineva kiirusega nende massi põhjal. Iga kord, kui lisate geelile uue komponendi, lülitage see üle uuele pipetile.
3
Lisage 30% akrüülamiidi lahus. Akrüülamiidi standardlahus koosneb akrüülamiidi isolaatidest, mis on infundeeritud ülipuhtasse vette. Akrüülamiidi lahus toimib maatriksina valkude ja nukleiinhapete eraldamisel. Vajadusel saate ise valmistada 30% lahuse, kombineerides 30% (w/v) akrüülamiidi ja 1,0% N,N′-metüleen-bisakrüülamiidi sobivas kontsentratsioonis vees.
4
Lisage vajalik kogus 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Kasutage jällegi värsket pipetti ja olge ettevaatlik täpse koguse lisamisel. Tris-HCI lisamine tagab, et segatud komponendid teie geelisegus püsivad konstantsel pH-tasemel. Tris-HCI (lühend “tris(hüdroksümetüül)aminometaanvesinikkloriidist”) on teatud tüüpi puhvrit, mida tavaliselt kasutatakse keemilistes protseduurides ja katsetes.
5
Lisage 10% ammooniumpersulfaati (APS). APS on võimas oksüdeeriv aine, mida kasutatakse sageli polümeeri keemias kokatalüsaatorina. Koos TEMEDiga on see oluline polümerisatsiooni käivitamiseks, mis on keerukas sidemete moodustamise protsess, mille käigus vedel segu tahkub geeliks. Parimate tulemuste saavutamiseks valmistage iga kord, kui akrüülamiidgeeli valate, uus partii APS-i lahust.
6
Reaktsiooni katalüüsimiseks lisage viimasena tetrametüületüleendiamiin (TEMED). Kui olete ülejäänud komponendid kokku viinud, pigistage TEMED peal. TEMED on geelelektroforeesis kasutatav esmane katalüsaator. See käivitab polümerisatsiooni kohe, kui see segusse siseneb, seega olge valmis geeli kohe pärast lisamist valama. TEMED on oluline lisada viimasena, kuna see vastutab reaktsiooni käivitamise eest. Siin kirjeldatud protseduur (ja ka lisamise järjekorda) võib korrata ka virnastamisgeelide valmistamiseks, ainus erinevus on iga komponendi täpne kogus.
7
Asetage õhuke plaat paksule plaadile ja joondage kahe plaadi servad. Geelelektroforees viiakse läbi kesta sees, mis koosneb kahest eraldi klaasplaadist, millest üks on veidi paksem kui teine. Selle korpuse ehitamise alustamiseks virna “lühike” plaat “kõrge” plaadi peale nii, et õhem plaat peal. Kahest plaadist paksemal on sisseehitatud vahetükid, mis loovad kitsa kambri, kui toetuvad vastu plaati. õhem plaat.
8
Lükake virnastatud plaadid valuraami ülaosas olevasse pilusse. Lühike plaat peaks olema suunatud raami esikülje poole, kõrge plaat ja tühikud peaksid olema nähtavad vastasküljelt. Kui plaadid on tihedalt raami sees, lükake raami mõlemal küljel olevad hingedega väravad tahapoole, et need paigale kinnitada. Kontrollige, kas joondatud plaatide paarist moodustatud alumine serv on mõlemaga täiesti paralleelne. valuraami alumine osa ja selle all olev tööpind. Valuraam on tavaliselt vormitud rohelisest plastikust, mis muudab selle ülejäänud seadmest koheselt eristatavaks.
9
Asetage valuraam valualuse korpusesse. Tõstke aluse ülaosas olevat U-kujulist klambrit, sisestage raam lühikese plaadiga väljapoole, seejärel langetage see uuesti, et raam alla lukustada. Katsetage kahe tüki vahelist ühendust, et veenduda, et raam ei nihku aluse sees ega liigu. Kui see on kokku pandud, peaks kahe plaadi vahel olema täpselt piisavalt ruumi geelisegu sissevoolimiseks.
10
Toruge vedel geelisegu kambri ülaosas olevasse avasse. Lisage segu klaaspipetti ja pirniga, kuni see on klaaskesta välisküljel oleva täitejoonega ühtlane. Ärge muretsege õhumullide pärast, mida võite näha kesta sees, nendega tegelete enne, kui lasete geelil täielikult polümeriseerida. Kui teie kasutataval seadmel ei ole täitejoont, mõõtke umbes 1 sentimeeter (0,39 Â). sisse) allapoole klaasi ülaosast “aken”, mis on nähtav valuraami sees, ja tehke sinna vildiotsaga markeriga märk.
11
Valage segu degaseerimiseks etüülalkoholi, isopropanooli või n-butanooli kiht. Täitke värske pipett oma valitud alkoholiga ja pigistage see sujuva edasi-tagasi liigutusega vähehaaval kambrisse. Jätkake alkoholi infundeerimist, kuni see täidab ümbrise ülejäänud ruumi, umbes 1 cm (0,39 tolli). Alkoholikihi lahus mitte ainult ei aita lahustada kinnijäänud hapnikku, vaid takistab ka muude keskkonnagaaside sattumist valmisgeelisse. Virnastatud geele ei ole üldjuhul vaja degaseerida, kuna eraldi kihid toimivad ühe pideva maatriksina, võimaldades valguproovidel elektri mõjul vabalt läbi geeli liikuda.
12
Laske geelil toatemperatuuril vähemalt 20-30 minutit tarduda. Nüüd jääb üle vaid seada taimer ja lasta geelil umbes pooleks tunniks segamatult seista. Selle aja jooksul lõpeb see polümerisatsiooniga, kõvenedes järk-järgult tihedaks geeliks. Vältige geeli liigutamist, tõukamist, geelile millegi lisamist ega muul viisil segamist geelile, kui see on hõivatud polümerisatsiooniga. Kui aeg lubab, saate ettenähtud polümerisatsiooni pikendada 45-60 minutini, et olla kindel, et geel on jõudnud täielikult tahkuda.
13
Kui geel on hangunud, tühjendage või image alkoholiga kaetud lahus. Valage alkohol keemilise kraanikaussi või sobivasse vedelate jäätmete prügikasti või kasutage selle ära imemiseks filterpaberilehte. Nüüd on teil võimalus oma geeli kohe kasutada või edaspidiseks analüüsiks hoiule panna. Mõned keemikud soovitavad ka valatud geeli ülemist pinda väikese koguse deioniseeritud veega loputada.