Enamikul juhtudel tehakse bakterite tuvastamine elimineerimisprotsessi kaudu, et kitsendada valikuid, kuni jõuate õigeni. Selle õigesti tegemine on uskumatult keeruline protsess, osaliselt seetõttu, et teadlaste hinnangul võib bakteriliikide arv olla üle miljardi! Isegi kui valida on nii paljude vahel, on tuvastamine eriti oluline kliinilistes ja meditsiinilistes tingimustes. Asjade lihtsustamiseks on olemas standardid, mille abil saab tuvastada värvimistehnikaid bakterite välimuse uurimiseks ja bakterite reaktsioonide jälgimiseks erinevatele tingimustele.
1
Kasutage Gram-värvimist, et näha, kas bakterid on grampositiivsed või gramnegatiivsed. Gramvärvimine on protseduur, mis võimaldab jagada bakterid kahte levinud tüüpi: grampositiivsed ja gramnegatiivsed. Grampositiivsetel bakteritel on eriti paks rakusein (mis on valmistatud polümeerist, mida nimetatakse peptidoglükaaniks), mis hoiab värvainet paremini kinni kui gramnegatiivsete bakterite õhemad rakuseinad. Tavaliste grampositiivsete bakterite perekondadesse kuuluvad Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus ja Listeria. Common Gram negatiivsete bakterite perekonnad hõlmavad Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter ja Fusobacterium.
2
Kasutage ettevaatusabinõusid. Bakterid ja kemikaalid, mida te Grami peitsiprotseduuri ajal käsitsete, on kõik potentsiaalselt ohtlikud. Kandke peitsi tegemise ajal kaitseprille, ühekordselt kasutatavaid nitriilkindaid ja laborikitlit. Kui olete lõpetanud, pange ühekordselt kasutatavad kindad ja kõik muud saastunud jäätmed bioloogiliselt ohtlikku kotti. Järgige oma labori protseduure bioloogilise ohu koti utiliseerimiseks.
3
Tehke oma bakteriproovist slaid. Protsessi alustamiseks asetage väike tilk või tükk oma bakteriproovi steriilsele slaidile. Laske objektiklaas 3 korda läbi Bunseni põleti leegi, et proov kuum fikseerida. See hoiab ära proovi mahapesemise, kui lisate reaktiive või loputate slaidi.
4
Lisage slaidile 5 tilka kristallvioletti. Asetage kristallvioletset värvi tilgad kuumfikseeritud kultuurile. Laske proovil 1 minut kristallvioletses värvitoonis liguneda. Käe määrimise vältimiseks võite alusklaasi riidenõelaga paigal hoida.
5
Loputage pleki eemaldamiseks slaidi õrnalt. Kasutage väga õrna veejuga kraanikausist või pritspudelist. Ärge loputage kauem kui 5 sekundit. See protsess eemaldab kõik värvained, mis ei ole prooviga seotud.
6
Lisage slaidile 5 tilka Gram’s Joodi. Grami jood on joodi, kaaliumjodiidi ja naatriumvesinikkarbonaadi lahus. See lahus põhjustab kristallvioletse värvaine sulandumise bakterite rakuseintega. Lisage umbes 5 tilka ja laske 1 minut seista.
7
Loputage proovi alkoholi või atsetooniga. Alkohol ja atsetoon on värvieemaldajad. Kui teie bakterid on gramnegatiivsed, eemaldavad need ained bakteriraku seintelt pleki. Laske mõnel tilgal värvieemaldusainet proovile nõrguda ja laske sellel seista mitte rohkem kui 3 sekundit. Alkoholi või atsetooni eemaldamiseks loputage õrnalt veega kuni 5 sekundit. Kui lasete värvieemaldusainel proovil liiga kaua seista, võib see eemaldada pleki grampositiivsetest bakteritest, põhjustades vale gramnegatiivse tulemuse.
8
Värvige lahus safraniiniga. Safraniin on punane värvaine, mis toimib kristallvioletse vastuvärvina ja värvib kõik bakterid, mis ei hoidnud violetset plekki. Lisage proovile umbes 5 tilka safraniini lahust ja laske sellel 1 minut seista. Loputage väga õrnalt veega 5 sekundit.
9
Vaadake oma proovi mikroskoobi all 1000-kordse suurendusega. Kui bakterid on grampositiivsed, on need mikroskoobi all lillad või violetsed. Gramnegatiivsed bakterid paistavad safraniini vastuplekist punasena.
10
Happekindlate bakterite tuvastamiseks kasutage Ziehl-Neelseni värvimist. Happekindlad bakterid sisaldavad suuremas koguses lipiide kui muud tüüpi bakterid, muutes need resistentseks Grami värvimisel kasutatavate värvainete suhtes. Happekindlad bakterid kuuluvad perekonda Mycobacterium, kuhu kuulub ka tuberkuloosi põhjustav bakter (M. tuberculosis). Happekindlaid baktereid saab värvida punase karbool-fuksiinvärviga, mis on vastupidav happelise alkoholi või väävelhappe lahusega loputamisele.
11
Võtke kasutusele asjakohased ettevaatusabinõud. Ziehl-Neelseni värvimisprotseduuris kasutatavad kemikaalid ja bioloogilised materjalid võivad olla ohtlikud. Kasutate ka soojusallikaid, nagu Bunseni põleti, piirituslamp või elektriline liugkütteseade. Selle protseduuri tegemisel järgige järgmisi ettevaatusabinõusid: kandke kaitseprille, nitriilkindaid ja laborikitlit. Olge ettevaatlik, et te ei hingaks sisse värvimis- ja värvieemalduslahuste aure ega satuks neid nahale või silmadesse. Hoidke avatud anumaid tõmbekapi all. Olge slaidi soojendamisel väga ettevaatlik, kuna paljud kasutatavad kemikaalid on tuleohtlikud. Slaidiriiulitel ja muudel seadmetel võib olla ka tuleohtlike kemikaalide jälgi.
12
Valmistage slaid ette. Jaotage proovitükk ringjate liigutustega ühtlaselt steriilse objektiklaasi keskele. Teie määrimine peaks olema umbes 10 mm (0,4 tolli) x 20 mm (0,8 tolli).
13
Kuivatage slaid. Asetage slaid kuivatusrestile, määritud pool üleval. Laske sellel 30 minutit õhu käes kuivada. Ärge püüdke slaidi kuivatada.
14
Parandage oma määrimine kuumaga. Saate proovi kuumkinnitada, viies slaidi 2–3 korda üle Bunseni põleti leegi, määritud pool üleval. Teise võimalusena asetage slaid vähemalt kaheks tunniks elektrilisele alusklaasi soojendajale temperatuuril 65–75 °C (149–167 °F). Olge ettevaatlik, et proov ei kõrbeks ega keeks.
15
Lisage oma objektiklaasile karbooli-fuksiini plekki. Pange slaidile mitu tilka karbooli-fuksiini lahust. Lisa nii palju, et määrdumine oleks täielikult kaetud.
16
Kuumutage peitsitud slaidi, et plekk määrdile kinnituks. Kuumutage slaidi õrnalt Bunseni põleti või piirituslambi kohal, määrige külg ülespoole või asetage see elektrilisele slaidiküttekehale. Kuumutage slaidi, kuni see jõuab temperatuurini 60 °C (140 °F). Peaksite nägema, et aur hakkab tõusma. Laske kuumutatud plekil slaidil 5 minutit seista. Kui kasutate elektrilist alusklaasi soojendajat, seadke see 60 °C (140 °F) peale. Kui kasutate Bunseni põletit või piirituslampi, peate hoolikalt jälgima auru või auru välimust.Slaidi hoidmiseks soovitud temperatuuril tervelt 5 minutit, kuumutage seda perioodiliselt. Hoolitsege selle eest, et see ei keeks ega kõrbeks. või kuivatage plekiline määrdumine täielikult.
17
Loputage slaidi jaheda veega. Laske slaidil umbes 5 minutit jahtuda, seejärel loputage mõne sekundi jooksul väga õrnalt kraanist või pigistatavast pudelist puhta veega, et eemaldada kõik plekkid, mis ei ole prooviga seotud.
18
Katke määrdumine happepiirituse või väävelhappega. Lisage määrde täielikuks katmiseks piisavalt 3 mahuprotsenti (maht/maht) happelist alkoholi või 20% väävelhapet. Jätke hape slaidile, kuni plekk on muutunud väga kahvaturoosaks. Tavaliselt kulub selleks vähemalt 10 minutit.
19
Loputage slaidi puhta veega. Loputage õrnalt veega kraanist või pigistatavast pudelist, pestes kindlasti ära kogu happe ja kõik järelejäänud värvaine jäljed.
20
Lisa slaidile vastuvärv. Kui slaid on loputatud, katke plekk malahhiitrohelise või Loeffleri metüleensinise lahusega. Need lahused loovad rohelise või sinise “tausta”, mis aitab punaseks värvitud bakteritel silma paista ja värvib ka muid slaidil olevaid bioloogilisi materjale (nt inimrakud ja bakterid, mis ei ole happekindlad). Laske plekil seista 1-2 minutit.
21
Loputage ja kuivatage slaid. Peske slaidi õrnalt puhta veega, et eemaldada liigne plekk. Kui olete lõpetanud, pühkige slaidi tagakülg puhta lapiga ja asetage slaidi restile õhu käes kuivama.
22
Uurige slaidi mikroskoobi all 1000-kordse suurendusega. Happekindlad bakterid peaksid olema punased või kuumad roosad. Mittehappekindlad bakterid, mittebakteriaalsed rakud ja taust on sinine või roheline.
23
Jälgige bakterite kuju. Kui olete kasutanud värvimist, et teha kindlaks, kas teie bakterid on grampositiivsed, gramnegatiivsed või happekindlad, on aeg bakteritüüpi kitsendada. Esimeseks sammuks on slaidil olevate bakterite kuju(de) jälgimine. Kolm levinumat kuju on kokk (sfääriline), bacillus (pulgakujuline) ja spiraal. Kõigil neil kujunditel on palju variatsioone. Näiteks võivad kookibakterid esineda mitmesugustes moodustistes, nagu liitpaarid (diplokokk), ahelad, kobarad või 4-liikmelised rühmad (tetrad).
24
Tehke kindlaks, kas bakterid on aeroobsed või anaeroobsed. Võtke 2 bakteriproovi ja looge 2 eraldi kultuuri. 1 kultuur peaks olema anaeroobne (kasvatatud ilma hapnikuta) ja teine aeroobne (hapnikuga kasvatatud). Hoidke oma anaeroobset kultuuri hapnikuvabas keskkonnas temperatuuril 35 °C (95 °F) vähemalt 48 tundi, enne kui proovite jälgida bakterite kasvu. Kui teie bakterid kasvavad hapnikuvabas keskkonnas, kuid mitte kokkupuutel hapnikuga, nad on anaeroobsed.Bakterid, mis kasvavad hapnikuga kokkupuutel, kuid mitte hapnikuvabas keskkonnas, on aeroobsed.Baktereid, mis võivad kasvada mõlemas keskkonnas, nimetatakse fakultatiivseteks anaeroobideks.
25
Tehke motoorika test, et teada saada, kas teie bakterid on liikuvad. Liikuvad bakterid võivad liikuda iseseisvalt, kasutades enda liikumiseks ühte või enamat lipukest. Motiilsus või liikuvuse puudumine võib olla oluline tegur bakteritüve tuvastamisel. Motiilsuse teste on mitut tüüpi, kuid pooltahke keskmise test on kõige turvalisem ja lihtsamini loetav.
26
Looge oma motoorikatesti jaoks kultuur. Valmistage bakterikultuur toitainepuljongis. Valmistage puljong vastavalt oma eelistatud puljongisöötme juhistele.
27
Inokuleerige pooltahke liikuvusagari katsuti oma kultuuriga. Katke steriilne inokuleerimisnõel mõne puljongikultuuriga. Torkake nõel ettevaatlikult otse liikuvuse testimiseks mõeldud pooltahke agari katsutisse (nt TTC agar). Nõel peaks ulatuma umbes 2/3 ulatuses agari sisse. Kui olete lõpetanud, tõmmake nõel ettevaatlikult välja, vältides selle esialgset torkejoont katki. Inkubeerige tuubi temperatuuril 30 °C (86 °F). ) 48 tunniks.
28
Lugege motoorikatesti tulemusi. Motility agar muutub bakteritega kokkupuutel punaseks. Kui teie bakterid on liikuvad, hajub punane või roosa värvus kogu agarile. Kui need ei ole liikuvad, näete punast värvi ainult piki algset torkejoont.
29
Pange tähelepanekud kokku. Bakterite perekonna kitsendamiseks peate ühendama oma plekkidest, kultuuridest ja bakterikuju vaatlustest saadud teabe. Kui testite patsiendilt saadud kultuuri, võib teave tema sümptomite kohta olla kasulik ka välja kitsendamiseks. Näiteks kui teie testid näitavad, et teie bakterid on gramnegatiivsed, anaeroobsed, mitteliikuvad batsillid ja need on seotud kõhuõõnega. valu, iiveldus ja oksendamine, on need tõenäoliselt Bacteroides fragilis.
30
Tutvuge bakterite andmebaasiga. Kuna bakteriliike on väga palju, on võimatu neid kõiki iseseisvalt meelde jätta ega ära tunda. Tõenäoliselt peate uurima kliinilise mikrobioloogia õpikut või veebiandmebaasi ja otsima baktereid, millel on kõik proovi tunnused. Bakterite tuvastamiseks on head veebiressursid hõlmavad Pathosystemsi ressursside integratsioonikeskust (patricbrc.org) ja patogeensete bakterite andmebaasi GlobalRPh-s. (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
31
Täpse bakteriliigi määramiseks kasutage geneetilist testimist. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks bakterite täpse liigi kindlakstegemine. Kiireim ja tõhusaim viis seda teha on DNA testimine. DNA-test on abiks ka traditsioonilistele kultiveerimis- või värvimisvormidele vastupidavate bakterite tuvastamisel. Kaasaegset mikroobse DNA testimist saab teha väga kiiresti, mõnikord isegi 2 tunniga. Kui teil pole juurdepääsu mikroobide genoomi järjestamist võimaldavale laborile, saatke proov spetsialiseeritud asutusse, nagu MIDI Labs või CD Genomics.